TÉCNICAS DE ESTRIADO.

Técnica de estriado básico

Calienta el asa de inoculación hasta que quede de color rojo intenso para eliminar cualquier microorganismo. Deja que el asa se enfríe durante 20 o 30 segundos, pero no lo soples para no reintroducir microorganismos. Recoge una muestra del cultivo bacteriano a partir de un caldo o una placa de Petri. No necesitas de una presencia bacteriana visible. Levanta la tapa de la placa de Petri que vas a sembrar en un ángulo de 45 grados, coloca el asa en la parte de atrás del plato, toca con el asa en el medio y pásalo a través de la superficie de la placa con un movimiento en forma de S desde atrás hacia adelante. Algunos laboratorios pueden querer que gires la placa a 90 grados y repitas el procedimiento de inoculación para una cobertura completa.

Estriado por cuadrantes

Este es también un método de estriado para el aislamiento, pero utiliza cuatro secciones en lugar de tres. Divide la parte inferior de la placa de Petri en cuatro partes iguales con un marcador permanente. Utiliza los procedimientos básicos de estriado para inocular el primer cuadrante. Trabaja en el sentido de las agujas del reloj, llevando los microorganismos de un cuadrante a otro, como lo hiciste con el método del estratificado en T y calentando el asa antes de inocular el siguiente cuadrante. Calienta el asa y barre en forma de S desde el primero hasta el cuadrante adyacente.

Tipos y Funciones de los medios de cultivo

Loa Medios de cultivo. Son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Son esenciales en el Laboratorio de Microbiología por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. 

Clasificacion:

De acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes

1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se preparan a partir de tejidos animales, y más raramente de vegetales. Su composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podrá ser exacta. En la práctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los más empleados.
2) Medios sintéticos: Son aquellos que contienen en su composición exclusivamente sustancias químicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composición perfectamente definida.
3) Medios semisintéticos: El gran número de factores de crecimiento exigidos para ciertos gérmenes hace que la fabricación de un medio sintético para estos gérmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos gérmenes no crecen en ningún medio por muy enriquecido que esté éste, haciéndolo exclusivamente en células vivas con unas características determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.

De acuerdo al uso del medio de cultivo

• Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.
• Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.
• Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos.

Atendiendo a su estado físico (consistencia)

1) Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración.

2) Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licúa a temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es la tempera óptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar:Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molécula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solución al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39ºC y nose funde por debajo de 85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vez fundido alrededor de los 45ºC. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgánicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacáridos, Araki, en 1937, los dividió en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de ácido pirúvico, y- agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporción de agarosa a agaropectina en el agar varía según el alga de origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los más importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriológico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales tóxicos.

3) Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias

SEGÚN SU UTILIZACIÓN.
1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc.
2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores  indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible añadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc)El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cisteína para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).
3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana específica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias.
4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante más restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adición de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una población determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los gérmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos.
5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. La adición de un azúcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los gérmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. También lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc.
6) Medios de identificación: Son los destinados a comprobar alguna cualidad específica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya añadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificación. Actualmente están apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios específicos de identificación para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultáneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificación. Son ejemplos de esto último los medios CPS ID3 o Uriline ID(Biomerieux), utilizados para identificar los gérmenes urinarios más importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilización de sustratos cromogénicos específicos.
7) Medios de multiplicación: Sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un microorganismo ya aislado. Seemplean en la obtención de vacunas, en la investigación y en la industria. Los medios más adecuados para la multiplicación suelen ser líquidos. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo típico de estos medios.
8) Medios de conservación: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en elLaboratorio de Microbiología. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas:
  a) haciendo pases periódicos de placa a placa,
  b) mediante liofilización de una suspensión bacteriana, y
  c) congelando las cepas en leche descremada estéril al 0,1%.
9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Suutilización debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior delmedio (generalmente en un tubo). Son ejemplos típicos de este grupo los medios de Stuart-Amies,Cary-Blair, etc.


 Para una informacion mas completa :  http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm

http://www.ecured.cu/index.php/Medio_de_cultivo_%28Microbiolog%C3%ADa%29

Metabolismo Bacteriano

 << https://www.youtube.com/watch?v=ZuUcWC9Z9pE >>

Ahora que conocemos la estructura de las células bacterianas, podemos estudiar las actividades que permiten la proliferación de estos microorganismos. Hasta los procesos vitales de los organismos muy simples incluyen una gran cantidad de reacciones bioquímicas complejas.

Aunque no la totalidad, la mayoría de los procesos bioquímicos de las bacterias se observan en los eucariotas y en las células de los organismos pluricelulares, incluido el hombre. Sin embargo las reacciones específicas de las células bacterianas les permiten hacer cosas que el ser humano no puede hacer. Por ejemplo, algunas bacterias pueden vivir de la celulosa y otras del petróleo, los procesos metabólicos bacterianos permiten que las bacterias reciclen elementos previamente utilizados por otros organismos. Las bacterias quimioautótrofas pueden vivir de sustancias inorgánicas como el dióxido de carbono, el hierro, el azufre, el hidrógeno o el amoniaco.
Definimos al  metabolismo microbiano como el conjunto de procesos por los cuales un microorganismo obtiene la energía y los nutrientes (carbono, por ejemplo) que necesita para vivir y reproducirse. Los microorganismos utilizan numerosos tipos de estrategias metabólicas distintas y las especies pueden a menudo distinguirse en base a estas estrategias. Las características metabólicas específicas de un microorganismo constituyen el principal criterio para determinar su papel ecológico, su responsabilidad en los ciclos biogeoquímicos y su utilidad en los procesos industriales.
A través del metabolismo, se transforman en el interior de la célula, distintas sustancias nutritivas que el organismo obtiene del medio. Estas transformaciones se llevan a cabo por distintas reacciones enzimáticas.
Las principales funciones del metabolismo son:

•  formar las subunidades que luego serán utilizadas en la síntesis de macromoléculas
•  Proporcionar la energía necesaria para todos aquellos procesos que la requieran como transporte activo, movilidad, biosíntesis, etc.

El metabolismo de las bacterias tiene muchos procesos en común con el metabolismo de las células eucariotas, pero  algunos procesos son exclusivos del metabolismo bacteriano
Algunas particularidades del metabolimo bacteriano son:

•  el metabolismo de la bacteria está adaptado para el crecimiento veloz y transcurre entre 10 y 100 veces más rápido que en las células humanas
•  la bacteria tiene mayor versatilidad en cuanto al tipo de nutrientes que puede utilizar para obtener energía
•  la bacteria tiene una mayor versatilidad en la utilización de oxidantes y no están limitadas al sólo uso del O2
•  existe una grandiversidad de requerimientos nutricionales entre las bacterias debido a que ellas no poseen todos los caminos biosintéticos
•  el cuerpo de los procariotas es muy sencillo, lo que le permite sintetizar macromoléculas por mecanismos menos engorrosos que los que utilizan las células eucariotas
•  algunos procesos biosintéticos son únicos de las bacterias, como los que conducen a la síntesis de mureína, ácidos teicoicos y lipopolisacárido

Métodos de tinciòn.

Métodos de tinción.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósítos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánìco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Morfología ultramicroscópica de las bacterias: estructuras internas

Pared celular

Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cápsulas y cubiertas mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que está en inmediato contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura rígida que da forma a la célula. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales.

Constituyentes importantes de la pared celular son los aminoácidos, aminoazúcares, azúcares y grasas. Estas sustancias (proteínas, Hidratos de carbono, grasas) están enlazadas formando el polímero complejo que forma la pared celular.

Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias gram-positivas contienen menos aminoácidos que las gram-negativas; el contenido graso es mucho más elevado en las gram-negativas que en las gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de la reacción al gram (ver las dos imágenes juntas).

Bacteria Gram Positiva	Bacteria Gram Negativa

También existen diferencias en la composición de la pared entre las células de las diversas especies.

Membrana Citoplásmica (citoplasmática o protoplasmática)

Inmediatamente debajo de la pared celular, existe una membrana fina, o envoltura, que se denomina membrana citoplásmica o protoplásmica y está formada por una bicapa de fosfolípido integral y proteínas periféricas empotradas. La membrana citoplásmica tiene una significación funcional de suma importancia. Se trata de una membrana semipermeable, selectiva, que controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la célula y la salida de los productos de desecho. Tiene enzimas respiratorias y durante la división celular el cromosoma se une a la membrana de la célula en el sitio llamado Mesosoma.

Citoplasma

El material celular contenido dentro de la membrana citoplásmica puede dividirse en tres partes, región citoplásmica, de apariencia granular, la cual es rica en RNA, región nuclear o cromatínica, que es rica en DNA, y la parte líquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos. El RNA, combinado con proteínas, forma partículas o corpúsculos macromoleculares, de unos 200 A de diámetro, que forman una masa densa y compacta en todo el citoplasma. Estas partículas de RNA-proteína se denominan ribosomas, y son el equivalente en las bacterias de los microsomas, o partículas que se encuentran en las células animales y vegetales.

Estructuras Citoplasmáticas

Nucleoide (cuerpo cromatínico)

Las células bacterianas no contienen el núcleo característico de las células de las plantas y animales superiores. Sin embargo, contienen en el citoplasma "cuerpos" que se consideran como una estructura nuclear, el ADN de la célula bacteriana se encuentra confinado en este espacio, es único y circular, doble hélice sin proteínas. Como no se trata de un núcleo discreto, se ha sugerido que se dé a estas estructuras las denominaciones de cuerpo cromatínico, nucleoides, equivalentes nucleares, y aun cromosomas bacterianos. Se demuestra con el método de tinción de Feulgen, específico para el DNA, y por microscopia electrónica, porque la sustancia nuclear es menos densa que el citoplasma cincundante.

Ribosomas

Tienen estrecha relación con la síntesis de proteínas (30S y 50S para formar un complejo 70S).

Plásmidos

Lazos extracromosómicos de ADN, algún código para la resistencia a drogas, toxinas y otros factores.

Endosporas

Algunas bacterias pueden transformarse en pequeños ovoides o esferas, que son formas celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen intracelularmente. Todos los organismos de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan, en parte, por su propiedad de producir esporas. También tienen esta propiedad otros géneros de bacterias verdaderas, pero sólo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de células vegetativas durante muchas generaciones. Sin embargo, en cierto período del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del citoplasma, la síntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora.

Otras tinciones de uso habitual

RODAMINA-AURAMINA

Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes.

Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la diferenciación morfológica.

NARANJA DE ACRIDINA

El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción.

El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial de hemocultivos positivos.

BLANCO DE CALCOFLÚOR

Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Según fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clínicos. También se emplea para aumentar la visualización de los elementos morfológicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratoríos ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, según la fuente luminosa que se utilice.

Estriado en tubos de ensayo.

               Estriado en tubos de ensayo.

Siembra en tubos de cultivo con medio sólido
Las siembras en tubos con medio sólido, por lo general se emplean para la conservación de un cultivo puro proveniente de una placa o para la siembra de pruebas bioquímicas como el medio OF, SIM y MIO. El pico del tubo.Del medio con agar se inocula primero por punción (cuando es necesario), seguido por una estría en el pico del tubo desde el fondo a la parte superior con un movimiento en “S” a medida que se retira el asa.

Siembra en medios de cultivo líquidos.
La siembra en tubos de cultivo en medio líquido, el tubo debe inclinarse en un ángulo de 30 ° y el asa de inoculación debe tocar la superficie interna del vidrio, justo encima del punto donde la superficie del agar forma un ángulo agudo. Cuando el tubo es vuelto a su posición vertical, el área de inoculación queda sumergida debajode la superficie, se puede agitar suavemente el asa en el interior del medio líquido.

Tipos de cultivo en tubos de ensayo:

Siembra por estrías en superficie:
Se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia con el asa estéril y sobre la superficie del medio se desliza ésta en forma de estrías.Se siembra el material  en la superficie de el agar inclinado en un tubo de ensayo,  allí se extiende por toda la superficie con el asa bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo estrías no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte más profunda de la superficie inclinada  y se termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo.


Por picadura o punción:
Se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado en forma inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picándolo longitudinalmente. Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se lo introduce en el tubo, con medio semisólido. Introducir la aguja hasta el fondo, formando un canal de punción, trayecto por el cual la retiraremos luego. Este método se utiliza para estudiar la movilidad de las bacterias. su
finalidad es  estudiar la movilidad de las bacterias
.
 Siembra en TSI: (Por picadura y estrías en superficie): el TSI (Triple Sugar Iron) es un medio que contiene glucosa, sacarosa y lactosa, hierro y un indicador que es el rojo fenol.
En este medio se siembra  por picadura y estrías en superficie,para estudiar los cambios que ocurran  en  la superficie y profundidad. 

Siembra por dilución: Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el caldo simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el  tubo con el uso del asa cargada con el  material bacteriológico, se agita, con movimientos moderados.Su finalidad es poner la bacteria en suspensión

Tipos de tincion

TÉCNICAS DE TINCIÓN

Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos; el diagnóstico bacteriológico generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias por lo que para poder observar a los microorganismos es necesario teñir la célula el cual resulta de un conjunto de reacciones fisicoquímicos muy complejos, algunas reacciones pueden ser irreversibles y otras no, por ejemplo algunos colorantes que han teñido en exceso pueden eliminarse con disolventes adecuados.
La mayoría de los colorantes utilizados en microbiología son derivados de la anilina, los colorantes están formados por uno o más anillos bencénicos conectados por uniones químicas bien definidas (cromóforos) que están bien asociados con la producción de color, teóricamente ciertos radicales químicos poseen la propiedad de absorber la luz de diferentes longitudes de onda, además poseen un grupo funcional llamado auxocromo que permite su unión a componentes con carga contraria presentes en la célula.
Los colorantes se designan como ácidos o básicos, termino que no indican necesariamente sus reacciones de pH en solución, sino más bien si una parte significativa de la molécula es aniónica o catiónica. Desde el punto de vista práctico, los colorantes básicos tienen estructuras de naturaleza ácida.
En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensión,
fijación, tratamiento con colorantes y observación.

Extensión: Se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es
líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de
H2O.

Fijación: Tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del mechero.

Tinción: Se realiza añadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a los procesos anteriores.
Puede ser de varios tipos:

TINCIÓN NEGATIVA:
Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su
contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina).

TINCIÓN SIMPLE:
Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tinción negativa, sólo
nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células.
􀂾 Tomar la preparación y colocarla en el recipiente dispuesto con el colorante que previamente les ha tocado
􀂾 Tomar el tiempo por 1 minuto y con la pinza de disección sacarlo del recipiente.
􀂾 Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua
􀂾 Dejar secar la preparación y observarla al microscopio.

La tinción de Gram

También puede utilizarse a menudo un método que no tiñe igualmente todas las
células, un proceso denominado tinción diferencial. La tinción de este tipo más
extensamente utilizada es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo
danés Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su reacción a la
tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, positivas y
negativas.
Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias
fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con
cierto detalle la tinción de Gram. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos
se tiñen primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son
tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este
estado todas las células, tanto las negativas como las positivas, están
teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) –
yoduro potásico (KI). El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico
simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las células y forma un
complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células
positivas como las negativas se encuentran en la misma situación. Se
lleva a cabo después de la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona,
sustancias en las que es soluble el complejo yodo – cristal violeta. Algunos
organismos (positivos) no se decoloran mientras que otros (negativos) lo
hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la resistencia a la decoloración. Después de la decoloración las células positivas son todavía azules, pero las negativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la
coloración de contraste las células negativas son rojas mientras que las positivas permanecen azules.

1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento de yodo. El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células.
2) La decoloración debe realizarse con poco agua para evitar que pierdan la tinción las células positivas. El proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.

Finalmente, el carácter de positivo no es siempre un fenómeno del todo o nada. Algunos organismos son más positivos que otros y algunos son variables, es decir, unas veces transpositivos y otras negativos. La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico.


Tinción ácido – alcohol resistencia

Esta tinción sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que tienen un alto contenido en lípidos y en ácidos micólicos y que no pueden ser calificadas por la tinción de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina – fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto las ácido – alcohol sensibles como las resistentes. Después se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias
ácido – alcohol sensibles se decoloren mientras que las ácido – alcohol resistentes se quedan rosa. Como en la tinción de Gram se utiliza un colorante de contraste que en este caso es el azul de metileno que tiñe las células ácido – alcohol sensibles de color azul quedando las células ácido – alcohol resistentes de color rosa.


Tinción de esporas

Se utiliza para teñir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas. Sobre el portaobjetos con la preparación se echa verde malaquita que tiñe las células de verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las células se quedan incoloras y las endosporas permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de color rosa mientras que las endosporas continúan con su color verde del verde malaquita.


Tinción negativa

Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir pero se colorea un cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Nutricion Bacteriana

Nutrición bacteriana

Cualquier ser vivo, por su actividad vital (crecimiento, mantenimiento y reproducción) requiere continuos aportes de energía para reponer las pérdidas y, para que todo el sistema pueda funcionar. La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las sustancias químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y se requieren para los dos objetivos que comprende el metabolismo:

1. fines energéticos o catabolismo (reacciones de mantenimiento)
2. fines biosintéticos o anabolismo (reacciones plásticas ).

Las biosíntesis de nuevos componentes celulares son procesos que requieren energía procedente del medio ambiente. Anteriormente señalamos los principales modos de captación y obtención de energía existentes en las bacterias.El estudio de la nutrición microbiana se puede desglosar en varios apartados: así, podemos considerar los tipos de nutrientes requeridos, los aspectos cuantitativos, e incluso podemos abordar los aspectos ambientales (en cuyo caso entramos dentro del campo de la Ecofisiología). Igualmente podemos estudiar la aplicación práctica de la nutrición bacteriana, que se plasma sobre todo en el diseño de medios de cultivo para manejar los microorganismos en el laboratorio.
Es importante tener claros desde el principio una serie de conceptos y nomenclaturas relacionados con los principales tipos de nutrición bacteriana. Puesto que, como acabamos de ver, la nutrición presenta un aspecto de aprovisionamiento de energía y otro de suministro de materiales para la síntesis celular, podemos hablar de dos "clasificaciones" de tipos de nutrición:
Desde el punto de vista de los fines de aprovisionamiento de energía, las bacterias se pueden dividir en:

1. litotrofas (del griego lithos = piedra): son aquellas que sólo requieren sustancias inorgánicas sencillas 
2. organotrofas: requieren compuestos orgánicos (hidratos de carbono, hidrocarburos, lípidos, proteínas, ......).

Desde el punto de vista biosintético (o sea, para sus necesidades plásticas o de crecimiento), las bacterias se pueden dividir en:

1. autótrofas: crecen sintetizando sus materiales a partir de sustancias inorgánicas sencillas. Ahora bien, habitualmente el concepto de autotrofía se limita a la capacidad de utilizar una fuente inorgánica de carbono, a saber, el CO₂.
2. heterótrofas: su fuente de carbono es orgánica (si bien otros elementos distintos del C pueden ser captados en forma inorgánica).

	autótrofas estrictas: son aquellas bacterias incapaces de crecer usando materia orgánica como fuente de carbono.
	mixótrofas son aquellas bacterias con metabolismo energético litótrofo, pero requieren sustancias orgánicas como nutrientes para su metabolismo biosintético.

Sean autótrofas o heterótrofas, todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos químicos, que se pueden clasificar (según las cantidades en que son requeridos) como

	macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg)
	micronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn, Mo...)

En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados, formando parte de sustancias orgánicas y/o inorgánicas. Algunos de los nutrientes serán incorporados para construir macromoléculas y estructuras celulares; otros solo sirven para la producción de energía, y no se incorporan directamente como material celular; finalmente, otros pueden ejercer ambos papeles.El mundo bacteriano, como conjunto, exhibe una gigantesca versatilidad metabólica de uso de nutrientes: desde autótrofos que obtienen su carbono por reducción del CO₂ y los demás elementos a partir de fuentes igualmente inorgánicas, hasta heterótrofos capaces de usar amplia gama de fuentes orgánicas de carbono.
A su vez, dentro de los heterótrofos, podemos encontrar muchos tipos de nutrición muy distintos, desde bacterias metilotrofas que sólo usan metano o metanol como fuente de carbono y energía, hasta los muy versátiles Pseudomonas, que pueden recurrir a degradar más de 100 tipos de fuentes de C, incluyendo sustancias tan "exóticas" como hidrocarburos alifáticos y cíclicos. De cualquier modo, entre los heterótrofos, una de las fuentes más típicas de carbono consiste en glucosa.

En los heterótrofos- organotrofos, los sustratos carbonados (con un nivel de oxidación no muy distinto del material celular -CH₂O-) entran simultáneamente al:

	metabolismo energético (o catabolismo, donde la fuente de C se transforma en CO2, o en CO2 junto con otras sustancias no totalmente oxidadas);
	metabolismo plástico (anabolismo = biosíntesis de nuevo material celular).

Aunque dentro del mundo de los procariotas se encuentre tanta variedad de nutriciones, las bacterias que pueden nutrirse solamente de sustancias inorgánicas sencillas (H₂O, CO₂, N₂, NO₃^--, NH₃, SO₄⁼, fosfatos, etc.) son minoría, pero sus procesos metabólicos son muy interesantes. De hecho, existen tipos metabólicos que sólo han evolucionado en procariotas.

eL AGUA

Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua. De hecho, salvo excepciones, se pueden considerar como organismos acuáticos. Requieren cierto grado de humedad para crecer. Desde el punto de vista de sus posibles papeles, el agua es:

	el principal constituyente del protoplasto bacteriano;
	el medio universal donde ocurren las reacciones biológicas;
	un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas reacciones bioquímicas).

Las fuentes de agua pueden ser:

	endógena: procedente de procesos de oxido-reducción;
	exógena (la más importante): procedente del medio, y que difunde a través de las membranas.

Ahora bien, no toda el agua de un ambiente está disponible para la bacteria:

	Existen determinadas sustancias y superficies que absorben y adsorben (respectivamente), de modo más o menos intenso, moléculas de agua, dejándolas inasequibles a la bacteria.
	Los solutos disueltos en agua (p. ej. , sales, azúcares) tienen afinidad por las moléculas de H2O que los rodean, por lo que éstas tampoco estarán a disposición del microorganismo.

eL ANHÍDRIDO CARBÓNICO (CO₂)

El anhídrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias:

	Las autótrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente de energía la luz (en el caso de las fotoautótrofas) u oxidaciones de determinadas sustancias inorgánicas (los quimioautolitotrofos).
	Las arqueobacterias metanogénicas pueden usar el CO2 como aceptor de los electrones procedentes de la oxidación del H2, proceso por el que obtienen su energía:

CO₂ + 4H₂ ---------> CH₄ + 2H₂O ( DG'0<0)

Los heterótrofos, aunque no usan el CO2 como fuente de C ni como aceptor de electrones, necesitan pequeñas cantidades para las carboxilaciones en determinadas rutas anabólicas y catabólicas.

El origen del CO₂ puede ser:

endógeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren al degradar la fuente orgánica de carbono;

exógeno: el CO2 de la atmósfera o disuelto en las soluciones acuosas. FÓSFORO Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgánicos o inorgánicos. Las bacterias que pueden usar los fosfatos orgánicos (merced a la posesión de fosfatasas) no dependen absolutamente de ellos, ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgánicos. Los fosfatos orgánicos son hidrolizados por fosfatasas extracelulares o (en las Gram-negativas) periplásmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina). SALES MINERALES Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl-) y de cationes para la célula. Los siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente grandes: K+, Mg++, Ca++, Fe++.