Tipos de tincion

TÉCNICAS DE TINCIÓN

Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos; el diagnóstico bacteriológico generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias por lo que para poder observar a los microorganismos es necesario teñir la célula el cual resulta de un conjunto de reacciones fisicoquímicos muy complejos, algunas reacciones pueden ser irreversibles y otras no, por ejemplo algunos colorantes que han teñido en exceso pueden eliminarse con disolventes adecuados.
La mayoría de los colorantes utilizados en microbiología son derivados de la anilina, los colorantes están formados por uno o más anillos bencénicos conectados por uniones químicas bien definidas (cromóforos) que están bien asociados con la producción de color, teóricamente ciertos radicales químicos poseen la propiedad de absorber la luz de diferentes longitudes de onda, además poseen un grupo funcional llamado auxocromo que permite su unión a componentes con carga contraria presentes en la célula.
Los colorantes se designan como ácidos o básicos, termino que no indican necesariamente sus reacciones de pH en solución, sino más bien si una parte significativa de la molécula es aniónica o catiónica. Desde el punto de vista práctico, los colorantes básicos tienen estructuras de naturaleza ácida.
En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensión,
fijación, tratamiento con colorantes y observación.

Extensión: Se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es
líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de
H2O.

Fijación: Tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del mechero.

Tinción: Se realiza añadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a los procesos anteriores.
Puede ser de varios tipos:

TINCIÓN NEGATIVA:
Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su
contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina).

TINCIÓN SIMPLE:
Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tinción negativa, sólo
nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células.
􀂾 Tomar la preparación y colocarla en el recipiente dispuesto con el colorante que previamente les ha tocado
􀂾 Tomar el tiempo por 1 minuto y con la pinza de disección sacarlo del recipiente.
􀂾 Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua
􀂾 Dejar secar la preparación y observarla al microscopio.

La tinción de Gram

También puede utilizarse a menudo un método que no tiñe igualmente todas las
células, un proceso denominado tinción diferencial. La tinción de este tipo más
extensamente utilizada es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo
danés Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su reacción a la
tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, positivas y
negativas.
Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias
fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con
cierto detalle la tinción de Gram. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos
se tiñen primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son
tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este
estado todas las células, tanto las negativas como las positivas, están
teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) –
yoduro potásico (KI). El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico
simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las células y forma un
complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células
positivas como las negativas se encuentran en la misma situación. Se
lleva a cabo después de la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona,
sustancias en las que es soluble el complejo yodo – cristal violeta. Algunos
organismos (positivos) no se decoloran mientras que otros (negativos) lo
hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la resistencia a la decoloración. Después de la decoloración las células positivas son todavía azules, pero las negativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la
coloración de contraste las células negativas son rojas mientras que las positivas permanecen azules.

1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento de yodo. El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células.
2) La decoloración debe realizarse con poco agua para evitar que pierdan la tinción las células positivas. El proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.

Finalmente, el carácter de positivo no es siempre un fenómeno del todo o nada. Algunos organismos son más positivos que otros y algunos son variables, es decir, unas veces transpositivos y otras negativos. La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico.


Tinción ácido – alcohol resistencia

Esta tinción sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que tienen un alto contenido en lípidos y en ácidos micólicos y que no pueden ser calificadas por la tinción de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina – fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto las ácido – alcohol sensibles como las resistentes. Después se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias
ácido – alcohol sensibles se decoloren mientras que las ácido – alcohol resistentes se quedan rosa. Como en la tinción de Gram se utiliza un colorante de contraste que en este caso es el azul de metileno que tiñe las células ácido – alcohol sensibles de color azul quedando las células ácido – alcohol resistentes de color rosa.


Tinción de esporas

Se utiliza para teñir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas. Sobre el portaobjetos con la preparación se echa verde malaquita que tiñe las células de verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las células se quedan incoloras y las endosporas permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de color rosa mientras que las endosporas continúan con su color verde del verde malaquita.


Tinción negativa

Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir pero se colorea un cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.